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人elisa試劑盒事項與步驟的幾點?
發布時間:2021-03-25   點擊次數:26次
  人elisa試劑盒事項與步驟的幾點?
  人elisa試劑盒操作步驟:
 ?。?)待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設3個平行孔;設兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設一個空白對照孔,加入純細胞裂解液100μl。
 ?。?)酶標板置4℃,包被過夜。
 ?。?)洗板:吸干孔內反應液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動。甩去孔內液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。
 ?。?)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
 ?。?)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min。
 ?。?)洗板,同(4)。
 ?。?)每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。
 ?。?)酶標板置37℃培養箱的濕盒內,孵育60min。
 ?。?)洗板,同(4)。
 ?。?0)每孔加TMB顯色液 100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應15-20min。
 ?。?1)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。
 ?。?2)分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2,zui終測得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
 ?。?3)數據處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的 OD值后,計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。
  人elisa試劑盒注意事項:
  1.邊緣效應 使用96孔板的ELISA測定中,常發現有“邊緣效應",即外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體,在實驗室的常規ELISA測定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,板也升溫時,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),就可以很容易地排除“邊緣效應",并且可提高測定的重復性。
  2.加樣在現在的ELISA商品試劑盒中,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關鍵點是:加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產生氣泡。加樣太快,無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區,易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。所以,有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性,下次測定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。
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