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細胞凍存和細胞復蘇對人ELISA試劑盒實驗的影響
發布時間:2021-01-21   點擊次數:64次
  細胞凍存和細胞復蘇對人ELISA試劑盒實驗的影響
  1. 液氮法
  目前,細胞凍存常用的技術是液氮冷凍保存法,主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分,減少細胞內冰晶的形成。人elisa試劑盒采用或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質分子量小,溶解度大,易穿透細胞,可以使冰點下降,提高細胞膜對水的通透性,且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外,人ELISA試劑盒減少胞內形成冰結晶的機會,從而減少冰晶對細胞的損傷。常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器,規格有35L3和50L3兩種。
  細胞凍存時常備的材料有:0.25%胰蛋白酶,含10%~20%的血清培養液,DMSO(分析純)或無色新鮮(121°C蒸氣高壓消毒),2mL安瓿(或細胞凍存管)、吸管、離心管、噴燈、紗布袋(或凍存管架)等。
  主要操作步驟為:
 ?。?)選擇處于對數生長期的細胞,在凍存前一天換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶,加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞,使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min,10分鐘)。
 ?。?)去上清液,加入含20%小牛血清的完全培養基,于4℃預冷15分鐘后,逐滴加入已無菌的DMSO或,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,細胞濃度為3×106~1×107/mL之間。
 ?。?)將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中,安瓿裝1~1.5mL在火焰噴燈上封口,封口處要完全封閉,圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊,并標記好細胞名稱和凍存日期,同時作好登記(日期、細胞種類及代次、凍存支數)。
 ?。?)將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內;置于液氮容器頸口處存放過夜,次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟:先將安瓿置入4℃冰箱中2~3小時,再移至冰箱冷凍室內3~4小時(此步可省略),再吊入液氮容器頸氣態部分存放2小時,zui后沉入液氮中。
  2. 分布降溫法
  細胞系凍存程序:
 ?。?)單層細胞的消化。將經24~48小時培養已長成單層的傳代細胞培養物棄去生長液,加適量ATV,1~2分鐘后倒棄ATV,再加入少量ATV液,經0.5~1分鐘倒去ATV,室溫或37oC溫箱作用2~3分鐘,視細胞解離情況,拍打細胞培養瓶。使單層細胞完全解離。SP2/0瘤細胞,待生長好后用吸管吹打,再經1 000轉/ 分離心lO分鐘。
 ?。?)離心洗滌:向培養瓶內加5~1 0m1預冷的MEM使細胞懸浮,人ELISA試劑盒再將其吸出置滅菌離心管中,以1 000rpm 離心8~10分鐘后棄去上清液。
 ?。?)細胞懸液的制備:向離心管內逐滴緩慢加入預冷的凍存保護液,使細胞濃度為150~400萬/ml,然后迅速分裝于安瓿瓶中,每瓶加量為lml。
 ?。?)致冷凍結:將安瓿瓶放入帶有棉墊的紙盒或塑料盒內,直立置不同條件下致冷凍結果保存:
  a、4oC兩小時后移至一2OoC作用2小時,再移入一4OoC4小時后在一7OoC下24小時投入液氮。
  b、一20oC4小時后移致一4OoC。C經4小時移人一7OoC冰箱24小時,投入液氮。
  c、一4OoC4小時后移入一70oC24小時后投入液氮。
  d、一20oC4小時后移入一70oC經24小時后投入液氮中。
  e、一70oC24小時后投入液氮中。
 ?。?)液氮中保存:將凍結后的安瓿裝入預冷的小布袋中,投入液氮。為防止安瓿漂浮,可預先在小布袋中加入幾塊小卵石。
  3.玻璃化法
  玻璃化保存(Vitrification)是一種超速冷凍方法。它是以極快的速度冷凍細胞,使細胞內外的游離水迅速形成玻璃樣物質,而不形成冰晶。人ELISA試劑盒這種保存方法既避免了由于慢速降溫時導致的鹽濃度升高,又防止了由于冰晶形成造成的物理損傷,可獲得較高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出,他認為生命是生物活體系統的原子或其他結構元的一種特殊排列.并且輕微的排列位置擾動就會破壞平衡從而導致死亡,而結冰時的驅動力會破壞這種特殊的排列,這就是冰凍死亡的原因。玻璃化比凍結固化方法引起的結構變化要小,因而是一種較理想的低溫保存途徑。1981年,Fahy首先明確提出,用高濃度的低溫保護劑溶液,可在較慢地冷卻速率以及高壓條件下實現完全的玻璃化,以后又發展了一些所謂“玻璃化溶液”,使細胞、組織乃至器官等范圍廣泛的生物系統玻璃化低溫保存成為可能。1985年,Rail和Fahy[ 目用這種玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存獲得成功,是這種技術走向實用化的突破。
  1.細胞復蘇的原則
  在實際操作中,凍存細胞要進行復蘇,再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化,以避免慢速融化水分滲入細胞內,再次形成胞內結晶損傷細胞。
  2.細胞復蘇的主要操作步驟
 ?。?)佩戴眼鏡和手套,從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
 ?。?)迅速放入38℃水浴中,并不時搖動,在1分鐘內使其完全融化,然后在無菌下取出細胞。
 ?。?)在1000r/min速度下離心5~10分鐘,棄去上層液,加入適量培養液后接種于培養瓶中,接種濃度1×109/L,置37℃溫箱靜置培養,次日更換一次培養液,繼續培養,觀察生長情況。若細胞密度較高,及時傳代?;驘o需離心直接將細胞加入瓶中,并加入培養基貼壁培養12~24小時后,充去上清,換入新鮮培養基繼續培養。
  3.注意事項
  在細胞復蘇操作時,應注意融化凍存細胞速度要快,人ELISA試劑盒可不時搖動安瓿或冷凍管,使之盡快通過zui易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高,生長及形態良好。然而,由于凍存的細胞還受其他因素的影響,有時也會有部分細胞死亡。人ELISA試劑盒此時,可將不貼壁、飄浮在培養液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉,再補以適量的新培養液,也會獲得較為滿意的結果。
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